Кључна разматрања у вези са дизајном за протоколе студије валидације уклањања вируса производа за генску терапију

ИЦХ К5А(Р2)-Међународна фондација за хармонизацију

ИЦХ К5А(Р2) је званично усвојен 1. новембра 2023. године и представља основни међународни водич за процену безбедности вируса. У поређењу са К5А(Р1) објављеним 1999. године, значајна ажурирања у верзији Р2 укључују: ново додато поглавље о процени вирусне безбедности у континуираној производњи (поглавље 7); појачана улога процене ризика као основе стратегија за уклањање вируса; укључивање секвенце следеће{10} генерације (НГС) у разматрање откривања вируса; и експлицитне захтеве за евалуацију нових производа и производних процеса. К5А(Р2) су усвојиле регулаторне власти, укључујући ФДА, ЕМА и ПМДА, обезбеђујући јединствен технички оквир за валидацију уклањања вируса широм света.

НМПА{0}}Кинески регулаторни систем

Регулаторни оквир НМПА за сигурност вируса покрива више нивоа:

Ниво документа	Назив документа	Година издања
Темељни документ	Техничке смернице за уклањање/инактивацију вируса из крвних продуката	2002
Темељни документ	Општи принципи за технички преглед процене вирусне безбедности биолошког ткива-производа добијених од еукариотске ћелије-изражених производа	2005
Смерница за{0}}специфичан производ	Техничке смернице за фармацеутска истраживања и процену апликација у клиничким испитивањима за рекомбинантне адено{0}}векторе повезане са вирусом (рААВ)-базиране ин виво производе за генску терапију	2023
Смерница за{0}}специфичан производ	Уобичајени технички захтеви за фармацеутски квалитет вектора рекомбинантног адено-повезаног вируса (рААВ)-базираних ин виво производа за генску терапију за апликације за лиценцирање	2025
Иновативна смерница	Техничке смернице за валидацију платформе процеса уклањања вируса за клиничка испитивања примене терапеутских рекомбинантних протеинских производа (проба)a	2024

а: Ова смерница представља први пут да је кинеско регулаторно тело поставило систематске техничке захтеве за валидацију платформе процеса уклањања вируса и усклађено је са духом ИЦХ К5А(Р2).

ФДА и ЕМА{0}}САД и европски регулаторни захтеви

ФДА је службено издала индустријски водич заснован на ИЦХ К5А(Р2) јануара 2024. Поред тога, поглавље Фармакопеје Сједињених Држава (УСП)<1050.1>пружа додатне техничке смернице о дизајну, евалуацији и карактеризацији поступака уклањања вируса. ФДА организује симпозијум о уклањању вируса сваке две године; Симпозијум 2023. се бавио најновијим-темама као што су нови модалитети, континуирана производња, нови медијуми за хроматографију и адсорптивни филтери. Основни документи ЕМА-е укључују ЦПМП/БВП/268/95 (Напомена за смернице о студијама валидације вируса: Дизајн, допринос и тумачење студија које потврђују инактивацију и уклањање вируса) и ЕМЕА/ЦХМП/БВП/398498/2005 на Вирус Сафеиделине на Вирус Сафеиделине Истражни медицински производи), оба су усклађена са ИЦХ К5А(Р2).

Идентификација извора вирусне контаминације

ИЦХ К5А(Р2) наглашава да дизајн валидације вирусног клиренса треба да се заснива на свеобухватној процени ризика. За производе генске терапије, идентификација извора вирусне контаминације треба да обухвати следеће нивое:

Ниво банке ћелија: Ендогени вируси (нпр. ретровирусне честице) и латентно инфективни вируси који се потенцијално налазе у супстратима ћелија за производњу (нпр. ХЕК293, ЦХО, ХеЛа). Познато је да ћелије ХЕК293 садрже ендогене Ад5 Е1 секвенце и ЕБВ фрагмент од приближно 900 бп, и да су способне да експримирају аденовирус{10}}компетентан за репликацију; стога овом ризику треба обратити посебну пажњу у процени ризика.

Ниво помоћног вируса: Производња ААВ вектора обично користи методе као што је трострука трансфекција помоћу помоћних плазмида, који носе ризик од генерисања -компетентног аденовируса за репликацију (РЦА). Слично, ћелије за паковање које се користе у производњи лентивирусних вектора могу да генеришу лентивирус-компетентан за репликацију (РЦЛ).

Ниво сировина: Адвентивни вируси се могу унети кроз сировине које се користе у производњи, укључујући медијуме ћелијске културе, храну и ензиме. Овај ризик је посебно значајан када се користе компоненте животињског порекла (нпр. фетални говеђи серум, раствори за варење трипсина).

Разлике у ризику: генска терапија наспрам традиционалних рекомбинантних протеина

Димензија ризика	Традиционални рекомбинантни протеински производи	Производи за генску терапију
Вирални извор	Ендогени вируси из банке ћелија; адвентивни вируси	Вируси банке ћелија; помоћни вируси; репликацијски{0}}компетентни вектори (РЦВ/РЦЛ); интеграција генома домаћина
Ћелијски супстрат	ЦХО, НС0, Сп2/0 и друге добро{3}}окарактерисане ћелијске линије	ХЕК293, ХеЛа, ЦХО, итд.; неке ћелијске линије су туморогеног порекла
Карактеристике производа	Лек на бази протеина{0}}; добро-дефинисану структуру	Вирусни вектор; представља ризике по биолошку безбедност
Стратегија валидације	Више{0}}уклањање вируса; нагласак на валидацији корака процеса	Потребна је РЦВ/РЦЛ детекција; валидација и тестирање су неопходни
Валидација платформе	Применљиво на успостављене процесе као што су С/Д, низак пХ, нанофилтрација	Ограничена примењивост због разноликости типова вектора

Табела 1. Поређење безбедносних ризика од вируса: производи за генску терапију наспрам традиционалних рекомбинантних протеинских производа

Општи принципи

Одабир вируса индикатора је централни елемент у дизајну протокола за валидацију уклањања вируса. ИЦХ К5А(Р2) захтева да избор вируса индикатора буде заснован на процени ризика и да узме у обзир следеће факторе:

Релевантност вируса за супстрат ћелије за производњу (релевантни вирус)

Физичко-хемијска својства вируса (са омотачем/без-обмотаја, ДНК/РНК, опсег величина)

Отпорност вируса на физичке/хемијске третмане

Детективност и биолошка сигурност вируса

За производе генске терапије, селекција вируса индикатора мора додатно узети у обзир: улогу самог векторског вируса као „релевантног вируса“; потенцијални ризик од контаминације помоћним вирусом; и захтеви за откривање и валидацију за вирусе{0}}компетентне за репликацију (РЦВ/РЦЛ).

Препоручена табла индикатора вируса

Вирус	Тип	Коверта	Геном	Величина (нм)	Образложење избора / примена
МВМ	Парвовирус	Ниједан	ссДНА	18–26	Модел без{0}}коверата; најмања величина и највећи отпор; погодно за валидацију нанофилтрације (генерално није применљиво за рААВ векторске производе)
ППВ	Парвовирус	Ниједан	ссДНА	18–26	Модел без{0}}коверата; најчешће коришћен индикаторски вирус за крвне производе
Рео-3	Реовирус	Ниједан	дсРНА	60–80	Модел без{0}}коверата; средње величине; висока физичка стабилност
ПРВ	Херпесвиридае	Да	дсДНА	150–200	Модел са омотачем; велика величина; широк распон домаћина
Кс-МуЛВ	Ретровирус	Да	ссРНА	80–110	Модел ретровируса са омотачем; прикладно за ћелијске супстрате добијене од ЦХО{0}}
БВДВ	Флавивиридае	Да	ссРНА	40–60	Модел са омотачем; користи се за процену метода хемијске инактивације (ХЦВ сурогат)
ВСВ	Рхабдовиридае	Да	ссРНА	70	Модел са омотачем; широка пХ толеранција; погодно за проверу ниског{0}}пХ инактивације

Табела 2. Препоручени панел индикатора вируса за валидацију уклањања вируса производа генске терапије

Посебна разматрања за ААВ векторске производе

За рекомбинантне ААВ векторске производе, НМПА техничке смернице за фармацеутска истраживања и процену апликација у клиничким испитивањима за рААВ векторске-базиране ин виво производе генске терапије захтевају пажњу на детекцију репликације{1}}компетентног ААВ-а (рцААВ). рцААВ се односи на ААВ способан за аутономну репликацију, која обично настаје из хомологне рекомбинације између помоћног плазмида и генома производа ААВ. Детекција рцААВ се генерално врши коришћењем инфективних тестова или кПЦР метода, које се спроводе одвојено на лековиту супстанцу и пречишћени производ.

Вреди напоменути да низводни процеси пречишћавања за ААВ векторске производе типично укључују дигестију нуклеазом, хроматографију (АЕКС), нанофилтрацију и хроматографију измене јона (ЦЕКС/ИЕКС). У традиционалној валидацији уклањања вируса, ови кораци процеса могу довести до значајних губитака самог ААВ вектора; стога, интеракција између вируса вектора и вируса индикатора мора бити пажљиво размотрена током дизајна-смањеног модела. За одређене кораке процеса (нпр. нанофилтрација) где су губици ААВ вектора значајни, треба проценити да ли су прилагођавања процеса оправдана на основу података о валидацији (нпр. подешавање величине пора нанофилтрационе мембране).

Општи принципи

Модел{0}}умањивања (СДМ) је основни алат за валидацију уклањања вируса; његов дизајн мора тачно да представља учинак уклањања вируса у производном процесу. ИЦХ К5А(Р2), одељак 6.2.2, изричито захтева да модел-смањеног нивоа одржи конзистентност са производним процесом у кључним параметрима. За производе за генску терапију, следећа разматрања су посебно важна у дизајну СДМ:

Репрезентативност критичних параметара процеса

Модел смањења{0}}треба да буде у складу са производним процесом у следећим параметрима: хроматографски услови (састав пуфера, пХ, проводљивост); однос оптерећења (однос масе вектор/супернатант протеина); време контакта и температура; проток/време задржавања; чистоћа и састав производа. За ААВ производе, утицај векторске дистрибуције величине честица и садржаја празног капсида на перформансе нанофилтрације такође треба посебно да се позабави.

Квалификациони захтеви модела

ИЦХ К5А(Р2) захтева адекватну квалификацију смањеног-модела, укључујући: поређење атрибута квалитета производа (нпр. чистоћа, опоравак, густина); квалификација конзистентности критичних параметара процеса; и осигурање{5}}смањеног модела обухвата варијабилност процеса производног процеса. За кораке хроматографије, конзистентност профила пикова, елуирања и испирања треба да буде квалификована; за кораке нанофилтрације, ефекте запреминског капацитета и састава производа треба проверити.

Формула за израчунавање ЛРВ

Вредност смањења дневника (ЛРВ) је основна метрика за мерење ефикасности уклањања вируса. ИЦХ К5А(Р2), одељак 6.5, даје детаљан опис метода израчунавања ЛРВ и статистичког третмана. Основна формула за израчунавање ЛРВ је: ЛРВ=лог₁₀(Н₀/Н), где је Н₀ почетни титар вируса након ширења вируса, а Н је преостали титар вируса након третмана. Када резидуални титар вируса падне испод границе детекције теста, треба користити методе процене као што је Поиссонова дистрибуција (нпр. тестирање великог{9}}обима).

Примена интервала поверења

И ИЦХ К5А(Р2) и ЕМА ЦПМП/БВП/268/95 захтевају процену интервала поверења резултата израчунавања ЛРВ. Обично се примењује интервал поверења од 95%.

Критеријуми за ефективност

Према НМПА техничким смерницама за уклањање/инактивацију вируса из крвних продуката, смањење вируса веће од или једнако 4 лог указује да је корак процеса ефикасан за уклањање/инактивацију вируса. Међутим, овај критеријум није апсолутни праг и треба га проценити на холистички начин заједно са кривуљама кинетике инактивације, научним образложењем за избор вируса индикатора и укупном исправношћу дизајна протокола за валидацију. За производе генске терапије, посебну пажњу треба посветити кумулативном капацитету чишћења у свим корацима процеса како би се осигурало да је укупни профил безбедности вируса на прихватљивом нивоу.

Примена и изазови нанофилтрације

Филтрација{0}}задржавања вируса (нанофилтрација) је критичан корак уклањања вируса у даљем пречишћавању производа генске терапије. Типични филтери{2}}за задржавање вируса имају величину пора од приближно 20 нм. Механизам уклањања вируса нанофилтрације првенствено се заснива на искључењу на основу величине- и може ефикасно да уклони већину вируса који су већи од величине поре на мембрани, укључујући мале парвовирусе без -не омотача као што су МВМ и ППВ.

Међутим, нанофилтрација за производе генске терапије суочава се са јединственим изазовима: величина ААВ вектора (приближно 20–26 нм) је слична оној код одређених индикаторских вируса (нпр. МВМ, 18–26 нм), што може довести до смањеног опоравка вектора; празни капсиди могу утицати на ток филтрације и ефикасност задржавања вируса; вискозност узорка може значајно порасти са концентрацијом вектора. Према томе, СДМ дизајн за валидацију нанофилтрације треба у потпуности да узме у обзир ефекте дистрибуције величине векторских честица и садржаја празног капсида на перформансе филтрације, а требало би размотрити коришћење нанофилтрационих мембрана са већим величинама пора према потреби.

Процена уклањања вируса у корацима хроматографије

Јоноизмењивачка хроматографија (ИЕКС) је кључни корак у процесима пречишћавања ААВ производа, који обично користи дигестију нуклеазом праћену хроматографијом измене ањона (АЕКС) да би се ухватили празни и неисправни капсиди, или хроматографијом измене катјона (ЦЕКС) за фино пречишћавање пуних капсида. Механизми уклањања вируса у корацима хроматографије укључују искључење величине, електростатичке интеракције, интеракције афинитета и друге факторе. Дискусије на ФДА 2023 симпозијуму о уклањању вируса нагласиле су да на ефикасност уклањања вируса корака хроматографије утиче више фактора, укључујући капацитет оптерећења, пХ, проводљивост и циклус смоле; за свеобухватну процену треба усвојити вишефакторски ортогонални приступ дизајну.

Контрола вирусне безбедности у континуираној производњи

Ново додато Поглавље 7 ИЦХ К5А(Р2) поставља специфичне захтеве за процену вирусне безбедности у континуираној производњи. За производе за генску терапију, континуирана производња је постала важан правац развоја, али уводи и нове изазове за безбедност вируса. Стратегије контроле безбедности вируса у континуираној производњи обухватају:-филтере за заштиту од вируса као критичне мере сузбијања; одговарајући дизајн времена боравка и токова процеса; уграђивање корака инактивације са дефинисаним временима задржавања; и побољшану примену процесне аналитичке технологије (ПАТ) за праћење-у реалном времену критичних параметара процеса.